重症监护病房抗凝新视角：凝血因子Ⅻ和Ⅺ抑制剂的基础与临床新进展
和Ⅺ抑制剂的基础与临床新进展
血栓性疾病一直是临床的常见病、多发病，抗凝、抗血小板和溶栓是治疗血栓性疾病的"三驾马车"。图1显示，目前常用的抗凝药物主要包括维生素K拮抗剂（华法林）、抗凝血酶激活剂（肝素、戊肝素、低分子肝素）及新型抗凝药物〔凝血酶抑制剂（达比加群）和凝血因子Ⅹa（factor Ⅹa，FⅩa）抑制剂（利伐沙班等）〕。肝素一直是抗凝治疗的常用药物，静脉注射可立即起效，能够通过监测活化部分凝血活酶时间（APTT）调整用量[1]；但长期使用肝素可导致肝素相关性血小板减少和骨质疏松。与普通肝素相比，低分子肝素的半衰期更长，药代动力学更固定，故可以根据体质量给药，且不需要严格监测，在大部分肝素临床适应证治疗中已逐渐替代普通肝素[1,2]；但皮下给药限制了低分子肝素在非住院患者中的应用，在肥胖和肾功能不全患者中的使用剂量也仍存在大量争议。在2010年新型口服抗凝药物用于临床之前，华法林一直是唯一的口服抗凝药物，但其需定期检测国际标准化比值（INR），并且与多种食物、药物存在交叉作用而降低了疗效或增加了出血风险[1,3]。与华法林相比，新型口服抗凝药物的剂量固定，无需频繁监测凝血功能，且食物与药物影响相对较小。但是，新型口服抗凝药物应用于心房颤动患者的年大出血发生率为2%～3%，颅内出血发生率为0.3%～0.5%，且不能用于机械瓣换瓣[3]。
目前的抗凝药物不能区分病理学凝血（即血栓形成）与生理学止血，因此现有抗凝治疗中最危及生命的并发症之一就是出血[4,5]。目前临床使用的抗凝药物都是通过直接或间接方式抑制共同通路的丝氨酸蛋白酶（即凝血酶或FⅩa）实现的，影响了凝血全程的3个阶段，即起始、扩增和放大。无论是FⅩ还是凝血酶，都是凝血共同途径中的酶，对于纤维蛋白形成至关重要。纤维蛋白也是生理学止血的主要成分，当机体出现小的破损时，共同途径被抑制，出血难以避免；而对于已经存在凝血功能异常的患者，出血风险则增加。因此，寻找一种既能预防血栓形成又不影响止血过程的抗凝药物一直是新药研发的热点。现从丙型血友病入手，阐明凝血的内源性途径（即接触途径）作用机制，以及为何接触途径抑制剂的出血风险远小于先用抗凝药物，并介绍一些代表药物，旨在向临床介绍这一当前热点研发的新型抗凝药物。
1 丙型血友病
1953年，Rosenthal等[6]发现，在一个家族的四代人当中，外科手术与牙科手术后均表现出与常人不同的出血倾向，研究者将其血浆与甲型血友病或乙型血友病患者的血浆混合后，发现其凝血缺陷恢复正常，这提示此类人群可能存在一种新的凝血因子缺乏；后续研究表明，这是常染色体隐性遗传病引起的FⅪ缺乏，且男女发病率无差异。研究显示，丙型血友病的发病率约为1/100万[7]，在德裔与伊拉克裔犹太人中更为常见[8]。FⅪ主要由肝脏合成，在胰腺和肾小管的朗汉斯细胞中也有少量分泌[9,10]。FⅪ活性低于20%即为严重FⅪ缺乏[11]。严重FⅪ缺乏症的出血倾向与损伤部位有关：与低纤溶活性组织损伤相比，高纤溶活性组织（如泌尿生殖道、口腔等）受损时，出血风险增加49%～67%[12]。当FⅪ活性低于30%时可导致APTT延长，但并不影响凝血酶原时间（PT）[13]；如APTT正常则可以排除严重FⅪ缺乏。如果怀疑FⅪ缺乏，则需特异性检测FⅪ的活性。在治疗方面，包括输注新鲜冰冻血浆、FⅪ浓缩物（仅欧洲部分国家可用）、小剂量基因重组Ⅶa及抗纤溶药物（如氨甲环酸、氨基己酸）。FⅪ活性低于20%的患者在接受大手术时需要补充FⅪ，目标是维持FⅪ活性为30%～45%。有研究表明，在实施纤溶活性较高部位的手术时，需要更高的FⅪ活性[11]。
丙型血友病给医学带来的影响并不是疾病本身。研究表明，FⅪ缺乏症患者不仅不会出现自发性出血，而且缺血性脑卒中的发生风险较不存在FⅪ缺乏症的同龄人明显降低[14]。但也有研究者发现，FⅪ的rs2289252和rs2036914基因多态性与静脉血栓栓塞症（VTE）显著相关，其机制可能与rs2289252的T等位基因和rs2036914的C等位基因增加了血浆FⅪ活性，进而促进了凝血过程有关[15]。在动物实验中发现，FⅪ缺陷小鼠缺血性脑卒中与血栓形成风险较非FⅪ缺陷小鼠明显下降；FⅪ缺陷兔导管相关性血栓形成的发生率也较非FⅪ缺陷兔明显下降[16,17,18]。上述动物实验还表明，虽然FⅪ在血栓形成中至关重要，但在止血过程中可有可无。丙型血友病的症状及其低血栓风险让人们开始重新思考抗凝治疗的作用靶点FⅫ与FⅪ。已有研究表明，接触途径抑制剂可能比目前的抗凝药物更安全[19,20]。
2 接触途径抑制剂——ICU抗凝新视角
目前，无论是在普通病房还是在ICU，侵入人体医疗设备的使用已经越来越多，如急性心肌梗死的支架置入、心脏瓣膜的机械瓣置换及体外膜肺氧合（ECMO）、主动脉内球囊反搏（IABP）、连续性肾脏替代治疗（CRRT）等器官支持措施。在使用这些侵入血管的器官支持设备过程中都需要抗凝，但现有的抗凝药物都存在出血风险，容易造成不良结局。共同途径中的酶被抑制，导致机体无法进行正常的生理学止血，是出血的主要原因。研究表明，FⅪ也可以影响免疫系统[21]，新的抗凝靶点也有可能影响着脓毒症的治疗[22]。或许在不久的未来，当脓毒症患者需要器官支持时，新靶点的抗凝治疗不仅可以精准地抑制人工材料表面引起接触途径激活导致的凝血，同时也存在着一定的抗炎作用，从而减轻过度的炎症反应对机体造成的伤害，提高脓毒症患者的生存率。
接触激活系统是接触途径的最上游成分，主要涉及FⅫ、血浆前激肽释放酶（prekallikrein，PK）、高分子量激肽原和FⅪ，这些凝血因子在特定的微环境中产生促凝和促炎活性[17,23]。接触系统在被激活后，不仅可以促进凝血，而且能促进血小板和白细胞的招募、补体的激活及缓激肽的生成[24]。FⅫ又称"Hagman因子"，是由肝脏合成的血浆糖蛋白，作为一种有催化活性的酶原，其在循环中的水平约为40 mg/L[25]。当FⅫ接触到人工材料时，如经皮冠状动脉介入治疗支架、ECMO管路、CRRT滤器的中空纤维柱管腔等带负电荷表面，会转化为丝氨酸蛋白酶激活的FⅫ，即FⅫa，从而引起构象改变，导致酰胺溶解活性（自激活）[26,27,28,29]，同时激活血浆PK形成激肽释放酶（prekallikrein activator，PKa），二者互相激活，迅速增加了血清中两种活性酶的活性。除人工材料外，各种感染的病原体、长链多磷酸盐和中性粒细胞胞外诱捕网也可以激活接触途径凝血系统[30]。FⅫ通过激活FⅪ来扩大凝血反应；FⅪa激活FⅪ后，触发FⅩa和凝血酶的生成。凝血酶可以通过反向激活FⅪ来放大接触途径（图2）。体外研究表明，FⅪ可以被凝血酶激活，而不依赖于FⅫ[31,32]。FⅪ是凝血扩增阶段的关键酶，可导致凝血酶过量产生，进而导致病理性血栓形成[33]。因为参与PKa-激肽系统，因此FⅪ也是连接血栓与炎症的枢纽[34]。
在ICU患者中，血液暴露于人工材料表面，如导管、CRRT滤器的中空纤维柱、ECMO管路，导致广泛的接触途径激活，从而导致凝血酶生成和血栓形成（局部血管内凝血病）。在血管外伤的情况下，大量组织因子释放，引发外源性凝血途径激活，产生大量的凝血酶，使纤维蛋白原变为纤维蛋白单体，封堵破损的血管，并不需要接触途径的参与（图3）。因此，抑制接触途径并不会干扰正常的止血过程，又可以防止局部血管内血栓的形成[35]。丙型血友病就是一个FⅪ处于抑制状态的例子。丙型血友病患者并没有自发性出血的倾向，这表明当机体受到损伤而导致血管破裂时，虽然FⅪ缺乏导致接触途径无法激活，但并不会影响组织因子释放，外源性凝血途径激活，血凝块形成并封堵血管的破口。在这样的精准抗凝模式下，可以避免小血管破损引起严重的出血并发症。丙型血友病患者术后出血的预防或治疗通常是输注新鲜冰冻血浆、FⅪ浓缩制剂或抗纤溶药物[12]。因此，当使用接触途径抑制剂又需要手术或较大的有创操作时，为了拮抗抑制的状态，可使用上述药物。这相对于现有抗凝模式需要等药物完全代谢后再进行有创操作，缩短了危重患者的等待时间。
通过回顾文献发现，FⅫ与FⅪ不仅在止凝血过程中发挥作用，而且参与脓毒症凝血病的过程。有研究表明，FⅫ与FⅪ可通过激活缓激肽参与炎症过程，从而导致细胞通透性增加、白细胞募集和炎症因子产生[36] （图4）。该研究者发现，给予FⅪ敲除小鼠注射大量李斯特菌后，其血清纤维蛋白水平、血小板计数和凝血酶-抗凝血酶复合物水平均显著降低，且白细胞介素-6（IL-6）含量亦出现明显降低[36]。在盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and perforation，CLP）诱导的脓毒症小鼠模型中，FⅪ缺陷小鼠较野生型小鼠更有生存优势，其病理学凝血更少，炎症反应更弱，血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-10水平更低[37,38]。从这些动物实验中可以发现，选择性抑制接触途径激活可以在不影响止血的情况下减轻脓毒症的免疫炎症反应。这样，当脓毒症合并器官功能衰竭而需要人工器官支持时，接触途径抑制剂既可以是抗凝药，又可以是炎症因子抑制剂。
FⅫ抑制剂与FⅪ抑制剂各有特点。在ECMO转机时需要抗凝，以免发生血栓；但肝素和其他凝血酶抑制剂即使在治疗剂量下也存在出血风险。在兔模型实验中发现，FⅫ或FⅪ降低至基线水平5%以下，可显著延长ECMO管路寿命，抑制FⅫ可防止ECMO导致的器官损伤[39]。FⅫa的完全抑制可以防止医疗设备相关的血栓形成，但是只要有凝血酶的存在，都可以绕过FⅫ而反馈激活FⅪ。因此，对于防止医疗设备相关的血栓形成，FⅫ和FⅪ双重抑制或FⅪ抑制剂可能比单纯抑制FⅫ的效果更好。
上述矛盾也决定了FⅫ与FⅪ抑制剂的研发力度。FⅫ的适用范围较窄，但出血风险更小，且不需要拮抗；而FⅪ抑制剂可以更彻底地阻断接触途径的激活，可能更具研发市场。基于这些凝血和脓毒症的研究，越来越多的FⅫ抑制剂进入了临床前试验阶段，FⅪ抑制剂进入了Ⅱ期、Ⅲ期临床试验阶段。部分化合物已经显现出令人满意的效果。
3 FⅫ与FⅪ抑制剂的临床药理新进展
FⅪ抑制剂包括三大类药物，即减少肝脏合成FⅪ的反寡义核苷酸、抑制FⅪ激活和FⅪa活性的单克隆抗体（单抗）及小分子FⅪa抑制剂。除此之外，FⅪ天然靶向抑制剂和适配体正在临床前的研发中（表1）。
3.1 反寡义核苷酸：
反寡义核苷酸是一种与肝细胞mRNA结合的RNA分子，从而阻断DNA的翻译，以及降低蛋白的表达水平，从肝细胞水平减少FⅪ的产生[5]。反寡义核苷酸可以导致促炎作用，诱导肝、肾毒性和血小板减少[40]。反寡义核苷酸不能被肾脏清除，因此更适用于需要血液净化治疗的肾衰竭患者[41]。目前两个FⅪ的反寡义核苷酸IONIS-FⅪRX和Fesomersen已经进入临床试验阶段。
3.1.1 IONIS-FⅪRX：
IONIS-FⅪRX又称FⅪ-ASO，是第一个抑制FⅪ表达的反寡义核苷酸，并进入Ⅱ期临床评估，可靶向作用于肝细胞中FⅪ mRNA，以剂量依赖的方式降低FⅪ的血浆水平，在小鼠和灵长类动物模型中进行的临床前研究表明其可降低50%血浆FⅪ水平，且不增加出血风险，具有明显的抗血栓作用[42,43,44]。
3.1.2 Fesomersen：
Fesomersen又称IONIS-FⅪLRX或FⅪ-LICA，是第二代反寡义核苷酸，具有N-乙酰半乳糖胺耦联结构，通过与肝脏中的唾液糖蛋白受体结合，介导肝细胞摄取。这种配体耦联的反寡义核苷酸比未耦联的分子更有效。在接受单侧膝关节置换术的患者中，相对于300 mg依诺肝素，Fesomersen在减少VTE事件方面效果更佳，出血事件也更少[10]。Fesomersen的进一步研究正在进行。
3.2 单 抗
3.2.1 Osocimab：
Osocimab又称BAY 1213790，是一种人免疫球蛋白G1单抗，可结合到FⅪa活性位点附近的区域，从而导致实质性的结构变化。Osocimab的作用启动迅速，平均血浆达峰时间为1～4 h，半衰期为30～44 d[45]。一项比较膝关节置换术后使用Osocimab与依诺肝素的血栓形成情况的试验显示，使用1.8 mg/kg Osocimab的血栓形成风险更低，出血风险也更低[46]。研究显示，单抗可能存在免疫原性，可导致注射部位过敏，因此超敏反应及输液反应发生率较高[47]。
3.2.2 Abelacimab：
Abelacimab又称MAA868，是一种人源性单抗，可与FⅪ的催化结构域结合，并将其锁定在酶原（非活性前体）构象中，从而阻止FⅪ进入血栓形成过程，并可抑制已经形成的FⅪa。静脉注射Abelacimab 1 h后可观察到游离FⅪ水平下降超过99%；在每月1次皮下给药后，游离FⅪ水平持续较基线水平显著下降[48]。当采用静脉注射时，Abelacimab的半衰期为25～30 d，允许每月给药（或术后单次给药），且体质量对其影响较小[49]。
3.2.3 Xisomab3G3：
Xisomab3G3又称AB023，是另一种在终末期肾病（ESRD）患者中达到Ⅱ期评估的单抗。它是一种重组人源性单抗，与FⅪ和FⅪa的A2结构域结合，并以剂量依赖的方式阻断FⅫa介导的FⅪ激活，既不抑制凝血酶的FⅪ激活，也不抑制FⅪa的促凝功能[49]。在一项安慰剂对照试验中，无肝素透析开始时给予单剂量Xisomab3G3后，血液透析回路中血凝块形成减少[50]。
3.3 小分子FⅪa抑制剂：
与单抗不同，小分子FⅪa抑制剂的相对分子质量有限（上限为900），使它们能快速跨膜扩散并到达细胞内的作用位点，从而快速启动和消除作用。与需要注射的反寡义核苷酸和单抗不同，小分子FⅪa抑制剂可以口服。考虑到FⅪa是一种具有胰蛋白酶样催化结构域的多肽，与前激肽蛋白具有结构相似性，针对FⅪa的小分子被设计为确保对FⅪa的高选择性，而并不是针对前激肽蛋白[9]。Milvexian是一种合成小分子，与FⅪa的活性位点结合，主要通过肝脏酶代谢细胞色素P450 3A4（CYP3A4；占40%～50%）和直接胆道排泄（占30%）进行代谢。因此，对于轻度和中度肝损伤患者，不太可能需要进行剂量调整[51]。Milvexian以剂量依赖的方式显著降低了膝关节置换术后VTE的发生率[52]。
国内的药物研发也有不俗表现。BJTJ-1837已经进入Ⅱ期临床试验阶段，其不是直接抑制FⅪa的酶活性，而是通过抑制FⅫa和凝血酶对FⅪ的激活，导致APTT延长，减少血栓形成，且不发生出血的不良反应，在人和食蟹猴的血浆中均显示出很强的抗凝血活性；此外，BJTJ-1837在食蟹猴的动脉静脉分流血栓形成模型中显示出良好的抗血栓活性，且具有剂量依赖性的保护作用，无出血的不良反应[53]。BJTJ-1837具有良好的药代动力学、药效学特性和良好的开发能力。SHR2285是另外一种已经进入临床试验阶段的国产小分子化合物，也是一种口服小分子FⅪa抑制剂。SHR2285及其主要葡萄糖醛酸代谢物SHR164471可以抑制人FⅪa的活性。已有研究证实，SHR2285在兔动脉血栓形成模型中具有良好的抗血栓形成性和低出血倾向；单剂量和多剂量的SHR2285在健康受试者中耐受性良好，表现出可以预测的药代动力学特征和剂量相关的药效学特征[54,55]。这些结果表明，SHR2285是一种很有前途的新型口服小分子FⅪa抑制剂。
3.4 FⅪ天然靶向抑制剂：
Ir-CPI是一种从蓖麻蜱唾液腺中分离出的含67个氨基酸残基的蛋白[56,57]，能有效抑制FⅫa和FⅪa。该蛋白具有一个Kunitz结构域，可高亲和力结合FⅫa和FⅪa，并抑制其活性。Ir-CPI延长了APTT，而不是PT。因此，Ir-CPI可能是预防医疗器械管路凝血的理想抗凝剂。目前该化合物还未进入临床试验阶段。动物实验显示，Ir-CPI可以减轻兔模型中导管血栓形成，减少兔动静脉分流模型血栓形成[56]。Ir-CPI在羊体外循环模型中预防凝血的效果与肝素一致[57]。因此，Ir-CPI可以防止导管和体外回路凝血。在Ir-CPI进入临床前，还有相当多的问题需要思考[58]：首先，Ir-CPI在动物模型中的疗效和安全性可能无法转化到人类。Ir-CPI在人体中的抗凝活性似乎比在动物模型中更强，这可能会增加出血的风险。其次，Ir-CPI对FⅫa和FⅪa并无特异性，因为Ir-CPI也可以抑制PKa和纤溶酶。虽然抑制PKa可以进一步减少医疗设备相关凝血的发生，但是抑制纤溶酶活性则可能会加剧凝血，而这一可能性仍需进一步研究明确。再次，在体外循环期间替代肝素时，因为FⅫ并不参与止血系统，因此FⅫa抑制剂可能不需要拮抗。先天性FⅪ缺乏症患者术后出血并不少见，FⅪa抑制剂可能需要拮抗。最后，作为外源蛋白，Ir-CPI可能具有免疫原性。此外，由于Ir-CPI需要通过胃肠外给药，因此在预防机械瓣换瓣患者的血栓栓塞方面，不能替代华法林。
4 展 望
精准医疗时代，任何医疗干预的靶点都要更明确，从而使效果更明显，副作用虽然不可避免，但也要尽可能规避。相对于现有抗凝模式治疗的疾病谱，新靶点的抗凝药物可能并不能颠覆其抗凝模式，但是有更多的需要终身抗凝的疾病会因为新靶点药物的问世而显著降低了出血风险，特别是年老体弱、多种器官受损的患者获益更大。在ICU中，器官支持大部分都需要侵入血管，抗凝过程中一旦出血，预后均不佳，新药物的问世无疑增加了这些患者的存活率。新的靶点不仅是凝血的作用位点，也是开启炎症因子的作用位点。现有临床试验均针对于凝血系统，那么当接触途径抑制剂问世后，更多用于脓毒症器官支持的抗凝时，可能对脓毒症引起的免疫失调有更多益处。无论是FⅪ抑制剂，还是FⅫ抑制剂，或者是两者同时使用，随着新靶点药物进入临床，越来越多接触途径抑制剂的研发会引领抗凝进入一个全新的世界，抗凝治疗指南液会迎来一个全面更新的时代！
引用: 王睿华, 杨智蕴, 马少林, 等. 重症监护病房抗凝新视角 凝血因子Ⅻ和Ⅺ抑制剂的基础与临床新进展 [J] . 中华危重病急救医学, 2024, 36(1) : 16-22.